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基因与疾病 | 肥胖可引发血管疾病——Wnt信号通路参与血管调节
时间:2019-12-31 16:39:54   

肥胖与血管疾病之间关系密切,脂肪组织(AT)的作用值得关注。AT有多种类型,其中血管周围脂肪组织(PVAT)能通过直接作用于血管壁而调节动脉粥样硬化。血管疾病的发生也受到氧化还原信号的影响,NADPH酶及其同源物NOX家族蛋白能生成与血管平滑肌细胞(VSMC)迁移有关的活性氧(ROS),NOX家族中NOX1和NOX2与GTP酶RAC1的生成有关。然而,肥胖对血管氧化还原的影响却尚不清楚。

Wnt蛋白可与卷曲蛋白(Frizzled)家族受体相互作用,激活细胞内信号传导,Wnt信号通路与细胞增殖、分化、迁移和不对称的细胞分裂有很大关系。AT分泌的WNT5A和SFRP5比例的失调与炎症和胰岛素抵抗的发生有关。结合上述情况,近日发表在《Science Translational Medicine》上的研究发现,肥胖人群中AT分泌的WNT5A和SFRP5的失调,会通过内分泌和旁分泌作用于血管壁,进而引发血管疾病。


1、探究肥胖、WNT5A/SFRP5和脉管疾病间的关系

研究团队首先在动脉粥样硬化患者AT中检测Wnt基因的表达,RT-PCR结果表明非经典Wnt信号通路中的WNT5A在四种脂肪组织中表达良好,并且在PVAT中表达最高,确定了WNT5A为后续研究对象。血液中WNT5A与SFRP5的Westernblot(WB)检测结果表明,肥胖人群中,WNT5A表达增高,SFRP5表达降低,并且血液和内脏AT中WNT5A与SFRP5的比值(WNT5A/SFRP5)与BMI关系密切(图1)。


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图1. 血液和内脏AT中WNT5A/SFRP5与BMI关系密切


研究者在肥胖人群的乳内动脉(IMAs)和PVAT中利用RT-PCR进一步检测WNT5ASFRP5的基因表达,发现在IMAs中,两种基因表达无明显变化;在PVAT中,WNT5A的表达增高,SFRP5表达降低。为明确WNT5A与SFRP5对冠心病的影响,研究团队分析了两种蛋白的浓度是否与冠心病有关。WB结果表明,冠心病患者血液中,WNT5A浓度高于正常人,SFRP5浓度低于正常人,统计学分析结果证明WNT5A/SFRP5是冠心病患病的危险因素(图2)。结合CT扫描获得的冠心病患者冠状动脉钙化情况和血液中WNT5A浓度,研究人员发现钙化组中血液WNT5A水平明显升高,说明WNT5A与钙化有关(图2)。


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图2. WNT5A/SFRP5是冠心病的危险因素,WNT5A与动脉钙化有关


2、WNT5A/SFRP5调节人类脉管壁氧化还原状态


借助荧光素发光法和染色,研究团队对肥胖人群IMAs中超氧阴离子(O2·-)进行检测,发现高BMI人群中基础O2·-和NADPH诱导产生的O2·-浓度升高。WNT5A/SFRP5蛋白的升高促进血液和IMA中O2·-浓度升高;WNT5A/SFRP5基因表达的增加促进PVAT中O2·-浓度升高,但不影响IMA中O2·-的变化。由于WNT5A基因在IMA中的表达远小于PVAT,由此作者认为WNT5A是通过旁分泌途径而非自分泌途径作用于血管壁(图3)。IMA培养基中添加WNT5A后,脉管基础O2·-增加为原来的4倍,NADPH诱导的O2·-增加为原来2倍多,添加SFRP5后O2·-减少。利用DHE染色观察O2·-定位,发现WNT5A增加的O2·-主要集中在血管平滑肌细胞中,并且WNT5A的这种功能可以被NADPH抑制剂抑制。WNT5A能抑制血管中NO的生成,并被SFRP5减弱。上述结论说明WNT5A能调节血管氧化还原状态。


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图3.WNT5A/SFRP5对基础O2·-和NADPH诱导的O2·-的调节作用


研究团队构建多西环素诱导的Wnt5a+/rtTA+小鼠模型,多西环素处理小鼠诱导WNT5A过表达后基础O2·-和NADPH诱导O2·-增加,说明WNT5A的过表达促进动脉NADPH氧化酶的活化。为探究WNT5A促进NADPH氧化酶活化的机制,检测人类IMAs和Wnt5a+/rtTA+小鼠模型中JNK激酶的磷酸化水平后,研究者确定了WNT5A能激活Wnt非经典信号通路PCP。WNT5A对脉管中GTP酶RAC1的激活,导致NADPH氧化酶的RAC1和P47phox亚基发生膜易位,进而激活NADPH酶功能(图4)。


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图4. WNT5A促使NADPH氧化酶的RAC1和P47phox亚基发生膜易位


为了探讨源自脂肪细胞的WNT5A是否可以发挥旁分泌作用来控制邻近VSMCs中的氧化还原状态,研究者通过检测GAPDH的浓度确定了WNT5A激活Wnt信号通路的作用浓度为400ng/ml,然而100ng/ml的WNT5A可增加基础NADPH诱导的O2·-,说明WNT5A直接作用于VSMCs。利用shRNA沉默细胞中WNT5A的表达,研究者发现VSMCs中O2·-浓度明显降低。为了进一步确定WNT5A在肥胖人群中的作用,研究团队利用siRNA沉默在肥胖人群脉管中上调的受体FZD2和FZD5,FZD2的沉默抑制了WNT5A引起的基础O2·-和NADPH诱导O2·-的增加,FZD5的沉默仅抑制基础O2·-增加(图5)。


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图5. FZD2和FZD5分别敲除后对O2·-的影响



3、WNT5A对VSMCs的迁移作用


为了探究WNT5A介导的氧化还原反应对VSMCs的影响,研究者向含有WNT5A的VSMCs培养基中加入Peg-SOD(O2·-清除剂),VSMCs的基因芯片检测结果表明,加入Peg-SOD后1890个基因出现差异表达,其中1057个基因上调,833个基因下调。差异表达的基因产生的蛋白参与细胞生长、分化、死亡和迁移,通过基因数据库对差异表达的基因进行功能注释,发现其中135个基因参与细胞运动。伤口愈合实验和Boyden小室侵袭模型实验表明,Wnt5A能在不影响增殖的情况下,以SFRP5可逆的方式促进VSMCs迁移(图6)。

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图6. Wnt5A能在不影响增殖的情况下,以SFRP5可逆的方式促进VSMCs迁移


4、泛素特异性蛋白17是WNT5A调节的氧化还原信号通路的下游调节器


为了确定氧化还原信号对WNT5A诱导的VSMCs迁移作用的影响,研究团队利用添加Peg-SOD和WNT5A的培养基孵育原代人类VSMCs,发现Peg-SOD抑制WNT5A诱导的VSMCs迁移,并且部分逆转了WNT5A引起的与迁移有关的基因表达,说明细胞内的氧化还原状态部分调节了WNT5A的迁移作用(图7)。WNT5A引起的差异表达基因中差异性最大的是泛素特异性蛋白酶基因17(USP17),它是去泛素化酶家族中具有串联重复序列的一个成员。qRT-PCR结果表明,WNT5A和Peg-SOD的添加,导致体外培养的VSMCs中USP17表达增加,利用shRNA敲除Hela细胞中的USP17后,WNT5A的处理无法激活RAC1,说明USP17在WNT5A激活RAC1功能中发挥重要作用(图8)。

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图7. Peg-SOD抑制WNT5A引起的细胞迁移

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图8. 敲除USP17抑制RAC1的激活

综上,作者证明了血液循环和PVAT中WNT5A和SFRP5平衡的变化,以及动脉壁上WNT5A受体FZD2和FZD5的上调,能结合肥胖因素,激活人类动脉壁中非经典Wnt信号通路,从而导致USP17介导的RAC1和血管NADPH氧化酶的激活,并诱导VSMCs迁移。临床水平上,WNT5A的浓度与冠心病的存在以及冠状动脉粥样斑块的钙化之间存在相关性。这些结果预示着,在肥胖人群中,UPS17和WNT5A具有预防和治疗血管疾病的潜在价值。 


注:文中所有图片引用自原文

原文及链接:Adipose tissue–derived WNT5A regulates vascular redox signaling in obesity via USP17/RAC1-mediated activation of NADPH oxidases.  https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aav5055


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